原始生殖細胞（primordial germ cell, PGC）是精子和卵子在胚胎期的祖先細胞（progenitor cell），是遺傳物質代際傳遞的細胞載體。因此，PGC是開展基因編輯和轉基因等遺傳操作的理想靶細胞。將遺傳操作后的PGC移植入內源PGC剔除的受體胚，利用受體高效產生遺傳操作的供體配子，一方面可以顯著提升遺傳操作的效率，有望獲得致死基因的母源合子突變體（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦）；另一方面有可能通過跨物種的PGC移植實現種間借腹生殖（Science China Life Science, 2022），突破精準高效的定向育種。因此PGC移植技術已成為動物遺傳操作和定向育種領域亟待突破和發展的重要技術。 

圖1 斑馬魚等魚類早期胚胎中僅存在極少數目的PGC

　　然而，供體胚胎往往僅具有極少數目的PGC，比如1000-細胞期的斑馬魚胚胎僅有4顆PGC（圖1），嚴重限制了PGC移植的成功率。如何建立一種普適高效的PGC誘導技術，成為這一領域亟待解決的首要科學和技術難題。在動物界，PGC特化存在兩種不同的模式：一種是以小鼠為代表的“后成論（Epigenesis）”，是指周圍信號誘導細胞團獲得PGC特性；另一種是以果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚和非洲爪蟾為代表的“先成論（Preformation）”，是指從母體繼承的生殖質（germplasm）因子直接決定了生殖細胞命運。在“后成論”動物中，已有少量誘導型PGC（induced PGC，iPGC）成功的報道（Nature，2013；Science，2022），但在“先成論”動物中尚沒有取得iPGC的突破。 

　　中國科學院水生生物研究所孫永華團隊長期從事魚類生殖細胞發育與生物技術研究。前期以斑馬魚和稀有鮈鯽為模型，初步建立了魚類單因子PGC異位誘導（J Genet Genomics，2020；Faculty of 1000推薦）和跨亞科物種間生殖干細胞移植借腹生殖（Science China Life Science, 2022）技術。12月14日，孫永華團隊在國際學術期刊Nature Communications發表了題為“Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors”的研究論文，首次采用“先成論”策略在斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎中高效誘導出iPGC，為硬骨魚類的PGC誘導和PGC移植借腹生殖建立了一個新范式。 

　　為了高效地誘導魚類PGC，作者首先將與PGC特化密切相關的9個生殖質因子（9GM：ddx4，dazl，piwil1，dnd1，nanos3，tdrd6，tdrd7a， dazap2，buc）和與PGC遷移相關的4個因子（4GM：rgs14a，cxcr4a，cxcr4b，ca15b）一同注射到1-細胞的斑馬魚胚胎中，發現幾乎所有胚盤細胞都變成GFP-UTRnanos3陽性的類PGC細胞。去除與PGC遷移相關的4因子后，9GM仍能高效的誘導出類PGC細胞。將誘導的類PGC細胞移植到內源PGC剔除的受體胚中，類PGC可以正確遷移到生殖嵴（圖2），且起始表達內源生殖質基因，表明這些類PGC具有典型的PGC特征，是真正的iPGC。 

圖2  9GM將斑馬魚胚盤細胞高效誘導為iPGC

　　接下來，研究人員使用Tg(cmv:GFP)和Tg(cmv:mCherry)轉基因胚胎分別作為iPGC移植的供體和受體。通過連續追蹤iPGC移植性腺的發育，發現嵌合體性腺生殖細胞均表達GFP，性腺體細胞均表達mCherry。最終，利用表達mCherry的親本產出了表達GFP的iPGC移植配子，其子代也能正常發育和繁殖。這表明，iPGC移植后能夠正常發育為成熟的配子。為了進一步證明9個生殖質因子能夠將任何一個胚胎細胞誘導為iPGC，作者嘗試將9GM注射入128-細胞時期的斑馬魚胚胎的單個胚盤細胞中，發現無論注射到動物極，還是胚盤邊緣的單胚盤細胞，9GM均能將該胚盤細胞誘導為iPGC，并進一步產生功能性配子，這表明9GM能夠將任一胚盤細胞誘導成為iPGC。 

　　重要的是，這種誘導策略在不同魚類間高度保守。作者發現，斑馬魚來源的9GM也能將稀有鮈鯽胚盤細胞高效誘導為iPGC；將稀有鮈鯽iPGC移植入斑馬魚胚胎后，可以利用斑馬魚高效產出稀有鮈鯽iPGC來源的種間借腹生殖精子（圖3）。 

圖3  稀有鮈鯽iPGC的高效誘導和iPGC移植種間借腹生殖

　　最后，作者試圖利用iPGC誘導和移植技術來解決魚類基因敲入實驗中面臨的一個致命難題——即基因敲入效率與胚胎存活率之間的矛盾。作者注射大劑量的基因敲入元件，以在囊胚期獲得盡可能高的基因敲入效率；通過注射9GM，將這些攜帶有大量基因敲入事件卻無法存活的胚胎細胞全部誘導為iPGC；再將這些iPGC移植入野生型受體胚胎，最終利用高存活率的野生型受體魚高效產生出了基因敲入的配子（圖4）。基因敲入與iPGC誘導結合實驗的成功，從根本上提升了斑馬魚基因敲入實驗中的種系傳遞效率。 

圖4 通過iPGC誘導和移植顯著提升基因敲入的種系傳遞效率

　　這一魚類iPGC誘導理論和技術的突破，真正解決了魚類PGC移植中供體PGC來源的瓶頸，不僅為斑馬魚等魚類基因功能研究提供了更為強大的工具，而且可用于養殖魚類的iPGC移植高效借腹生殖精準育種。相關成果發表于Nature Communications雜志，中國科學院水生生物研究所王小四特別研究助理為論文第一作者，?？■?/b>博士、王厚鵬工程師等參與該項研究，孫永華研究員為通訊作者。這項研究受到國家杰出青年科學基金、國家自然科學基金創新研究群體項目、國家重點研發計劃項目、中國博士后科學基金等資助。據悉，文中用到的斑馬魚和稀有鮈鯽來自于國家水生生物種質資源庫國家斑馬魚資源中心，相關載體也已保藏至該中心，并通過該中心對學術界提供相關資源和技術服務。